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    懸浮細胞的瞬時轉(zhuǎn)染操作

    發(fā)布時間: 2024-04-29  點擊次數(shù): 920次

    細胞轉(zhuǎn)染前的準備:

    懸浮細胞的瞬時轉(zhuǎn)染操作

    1.細胞:

    貼壁生長細胞:一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,必須用胰酶處理成單細胞懸液,重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,轉(zhuǎn)染當日的細胞密度以70%-90%(貼壁細胞),最好在轉(zhuǎn)染前2-4h換一次新鮮培養(yǎng)液。


    懸浮細胞:轉(zhuǎn)染前12-16h進行懸浮細胞傳代,傳代后適宜的細胞密度為20-40x104/mL。臺盼藍染色進行活細胞計數(shù)保持活細胞比在95%以上。


    提前將293F細胞的密度調(diào)整至合適的密度后(2×106 - 4×106細胞/ml)于37°C搖床培養(yǎng)2-4h后進行轉(zhuǎn)染。注意,參與轉(zhuǎn)染的細胞必須是培養(yǎng)三代或以上的穩(wěn)定細胞株。


    2.DNA:使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒,于生物安全柜/超凈臺用0.22um濾頭過濾除菌。


    3.稀釋液:于生物安全柜/超凈臺用0.22 μm濾頭過濾除菌。


    4、轉(zhuǎn)染試劑:轉(zhuǎn)染試劑如PEI溶液長期儲存于- 20℃,不可反復凍融,溶液在4℃放置不超過一周。


    操作步驟(懸浮細胞):

    1、取一支已滅菌的Ep管,加入一定量的DNA,以相應體積的300 mM NaCl稀釋,用槍頭混勻后靜置5 min;

    另取一支已滅菌的Ep管,加入相應體積的300 mM NaCl稀釋對應體積的PEI溶液用槍頭混勻后靜置5 min(稀釋液與DNA、PEI的總體積應為轉(zhuǎn)染體積的5%)。

    將質(zhì)粒和PEI溶液混合,槍頭混勻后靜置一段時間,使DNA與PEI形成穩(wěn)定的聚合物。

    2、從搖床中取出293F細胞。用1 mL移液槍滴緩慢滴加轉(zhuǎn)染混合液,邊加邊搖晃搖瓶使轉(zhuǎn)染更加充分。

    3、轉(zhuǎn)染后將懸浮細胞置于搖床中培養(yǎng),條件為37℃、8%CO2、110 rpm。每隔24 h進行細胞計數(shù)并用臺盼藍染色液觀察細胞的存活率。

    注意事項:

    1、DNA純度:使用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒大提試劑盒,細菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素對細胞狀態(tài)有很大的影響。

    用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無蛋白質(zhì),無RNA和其他化學物質(zhì)的污染,確保質(zhì)粒OD值A260/A280在1.8~2.0之間。

    提完質(zhì)粒后進行瓊脂糖凝膠電泳實驗驗證DNA的純度,通常情況下DNA為超螺旋狀態(tài)(此狀態(tài)下轉(zhuǎn)染效率更高)。

    2、優(yōu)化條件

    質(zhì)粒不同,所轉(zhuǎn)染的細胞不同及定量的準確性等因素會導致在一些情況下轉(zhuǎn)染效率低,蛋白表達量低,基于這種情況需要對質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑的配比、DNA的濃度、質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的聚合時間進行優(yōu)化。

    3、轉(zhuǎn)染的稀釋液

    研究報道,300 mM NaCl溶液稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率比普通培養(yǎng)基高。

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