原理

CCK-8 是 MTT 的升級產品，其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的線粒體內的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazan dye）。

生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比，與細胞毒性成反比，間接反映活細胞數(shù)量。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。

用途

用于細胞增殖測定、細胞毒性測定、藥物篩選、抗腫瘤藥物敏感性測定。

材料與儀器

【材料】細胞懸液

【試劑】 CCK8

【儀器，耗材】96 孔板，二氧化碳培養(yǎng)箱，酶標儀

步驟

1、取對數(shù)生長期的細胞制備細胞懸液，細胞計數(shù)；

2、根據合適的鋪板細胞數(shù)接種到 96 孔板中，每孔約 200 ul（2×103-2×104/孔）細胞懸液，同樣的樣本可做 3-5 個重復，將 96 孔板在 37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24,48,72 h；

3、設置空白對照組：不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照，其他試驗步驟保持一致。細胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)4-8小時；

4、加入20ul CCK8：由于每孔加入CCK8 量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。或者直接配置含 10% CCK8 的培養(yǎng)基，以換液的形式加入；

5、培養(yǎng)1-4小時:細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）；

6、測定 450 nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長 450-490 nm，參比波長600-650 nm。

注意事項

1、當在培養(yǎng)箱內培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔加培養(yǎng)基或者PBS，不作為測定孔用。避免邊緣效應。     

2、用酶標儀檢測前需確保每個孔內沒有氣泡，否則會干擾測定，且要擦拭干凈樣品板。

3、細胞種板數(shù)不易過多，否則細胞自身發(fā)生接觸抑制，影響OD數(shù)值，較長培養(yǎng)時間建議每孔加入200 μl培養(yǎng)基。                                    

4.若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24 小時內測定，吸光度不會發(fā)生變化。                 

5、懸浮細胞由于染色比較困難，一般需要增加細胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時間。

6、加入CCK-8 時，如果細胞培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基顏色或 pH 值已變化，建議換用新鮮的培養(yǎng)基。

常見問題

Q：96 孔板最邊緣的細胞吸光值都較大？

A：這是邊緣效應導致的，長時間培養(yǎng)過程中，一般邊緣的孔中培養(yǎng)基揮發(fā)較多，培養(yǎng)基中各成分相對濃縮，細胞生長會更快，不能正確反映真實的細胞生長速度，所以需要棄用周圍一圈孔板，加入培養(yǎng)基或 PBS。